今般、中国国内における牛乳へのメラミン混入事例を受け、メラミンを含有する食品の試験法を別添のとおり策定したので、御了知の上、今後は本試験法により検査を実施されたい。
別添 メラミン試験法
１．分析対象化合物
メラミン
２．性能基準
以下に示す性能を有する試験法とする。その評価は、分析対象食品に定量限界濃度又はその2倍の濃度のメラミンを添加して回収試験を行い、得られた結果に基づき行う。
原則として下記の要件に適合すること。
１）定量限界
0.5 mg/kg
２）選択性
分析対象化合物を含まない試料（ブランク試料）について操作を行い、定量を妨害するピークがないことを確認すること。妨害ピークを認める場合は、定量限界濃度に相当するピークの面積（又は高さ）の1/3未満であることを確認すること。
３）回収率
70～120%（内標準を用いる場合は、内標準の回収率が40%以上であること。）
４）併行精度
RSD＜10%（n≧5）
３．試験法例
別紙の試験法を参考例として示す。
（別 紙）
メラミン試験法例
１．分析対象化合物
メラミン
２．装置
液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計（LC-MS/MS）
３．試薬、試液
次に示すもの以外は、「食品に残留する農薬、飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法について」（平成17年1月24日付け食安発第0124001号。以下試験法通知という。）別添の第１章総則の３に示すものを用いる。
アセトニトリル 残留農薬分析用
50%アセトニトリル 等量のアセトニトリルと水を混合する
アンモニア水（25%） 5%アンモニア－メタノール溶液 アンモニア水（25%）とメタノールを1：19の比率で混合する
0.1及び１mol/L 塩酸
酢酸アンモニウム
水
メタノール
エチレンジアミン- N -プロピルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）
強酸性陽イオン交換体ミニカラム（500 mg）
0.2 μm PTFEフィルター
メラミン標準品（純度98%以上）
メラミン内標準品* 1 メラミン- 15 N 3 又はメラミン- 13 C 3 ・ 15 N 3
*1：林純薬又は和光純薬から入手可能
４．試験溶液の調製
１）抽出
均一化した試料5.0 gを量り採り、メラミン内標準品の50%アセトニトリル溶液（10 ■ochg/mL）0.5 mL及び50%アセトニトリル25 mLを加え、ホモジナイズ後、毎分3,000回転で5分間遠心分離し、上清を抽出液とする。
２）精製
① エチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）*2にメタノール５mL、50%アセトニトリル５mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに
１）抽出で得られた抽出液５mLを注入した後、50%アセトニトリル１mLを注入する。全溶出液を合わせ１mol/L塩酸130μLを加える。 *2：VARIAN Bond Elut PSA 500mgのカラムを用いて行った一例である。
② 強酸性陽イオン交換体ミニカラム（500 mg）*3 にメタノール5 mL、水5 mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに①で得られた溶出液を注入した後、0.1 mol/L塩酸２mL、メタノール１mLを順次注入し、流出液は捨てる。次いで５%アンモニア－メタノール溶液５mLを注入する。溶出液を減圧乾固した残留物に50%アセトニトリル10 mLを加え、5分間超音波処理する。得られた溶液１mLを採り、50%アセトニトリル１mLを加え、0.2μm PTFEフィルターでろ過する。得られたろ液を試験溶液とする。
*3：VARIAN Bond Elut SCX 500mgのカラムを用いて行った一例である。
５．測定条件
カラム：SeQuant ZIC-HILIC（内径2.1 mm、長さ100 mm、粒子径3.5μm）
カラム温度：40℃
移動相：A: 10 mM酢酸アンモニウム、B: アセトニトリル
A: 15%（0－4分）、60%（4－5分）
流速：0.2 mL毎分
保持時間：2.5分
注入量：５μL
イオン化モード：ESI（＋）
質量分析計パラメーター* 4 ：
| 測定対象化合物 |
 |
トランジション |
Cone（V） |
Collision（V） |
| メラミン |
ターゲット1 |
127 > 68 |
30 |
30 |
| ターゲット2 |
127 > 85 |
| メラミン内標準 |
ターゲット1 |
130 > 87 |
30 |
30 |
| ターゲット2 |
130 > 69 |
*4：質量分析計としてWaters Quattro Premier XE、メラミン内標準としてメラミン- 15 Nを用いて行った一例である。