食品、添加物等の規格基準の一部を改正する件（平成１７年厚生労働省告示第４９９号）が平成１７年１１月２９日に公布され、その内容については、同日付け食安発第１１２９００１号当職通知をもって通知したところである。 　これに関連して、今般、「食品に残留する農薬、飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法について」（平成１７年１月２４日付け食安発第０１２４００１号当職通知）の別添の一部を下記のとおり改正することとしたので、関係者への周知方よろしくお願いする。

記

１．目次を別紙１のとおり改める。なお、改正部分を下線で示す。

２．「第３章　個別試験法」の「アミトラズ試験法」及び「メトプレン試験法」を別紙２のとおり改める。

３．「第３章　個別試験法」の「ジクロフルアニド試験法」を別紙３に示す「ジクロフルアニド及びトリルフルアニド試験法」に改める。

４．「第３章　個別試験法」に別紙４に示す「クリスタルバイオレット及びメチレンブルー試験法」及び「セファゾリン、セファピリン、セファレキシン、セファロニウム、セフォペラゾン及びセフロキシム試験法」を加える。

別紙１

目　次

第１章　総則

第２章　一斉試験法

第３章　個別試験法

（参考）食品、添加物等の規格基準（昭和３４年厚生省告示第３７０号）に規定する試験法

別紙２

アミトラズ試験法（農産物）

１．分析対象化合物
アミトラズ
Ｎ－２,４－ジメチルフェニル－Ｎ'－メチルホルムアミジン（以下、代謝物という）

２．装置
アルカリ熱イオン化検出器付きガスクロマトグラフ（GC-FTD）又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ（GC-NPD）
ガスクロマトグラフ・質量分析計（GC/MS）

３．試薬、試液
　次に示すもの以外は、総則の２に示すものを用いる。
　アミトラズ標準品　本品はアミトラズ99％以上を含み、融点は87～88℃である。
代謝物標準品　本品はＮ－２,４－ジメチルフェニル－Ｎ'－メチルホルムアミジン98％以上を含み、融点は53～75℃である。

４．試験溶液の調製
１）アミトラズの試験溶液
①　抽出
ⅰ．穀類、豆類及び種実類の場合
試料10.0ｇを量り採り、水20 mLを加え、２時間放置する。
これに１mol/L水酸化ナトリウム溶液20 mLを加え、pＨ11以上であることを確認し、さらに、アセトン100 mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50 mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせ、35℃以下で約40 mLに濃縮する。
これに10％塩化ナトリウム溶液100 mLを加え、酢酸エチル及びｎ－ヘキサン（１：４）混液100 mL及び50 mLで２回振とう抽出する。抽出液を合わせ、0.2 mol/L酢酸溶液100 mL及び50 mLで２回振とう抽出する。この抽出液(a)を代謝物の抽出液とする。
一方、残った酢酸エチル及びｎ－ヘキサン混液の層を、10％塩化ナトリウム溶液20 mLに１mol/L水酸化ナトリウム溶液１mLを加えた溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。
この残留物をｎ－ヘキサン30 mLに溶解し、ｎ－ヘキサン飽和アセトニトリル30 mLずつで３回振とう抽出する。抽出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びｎ－ヘキサン（１：49）混液２mLを加えて溶かす。

ⅱ．果実、野菜、ハーブ、茶及びホップの場合
果実、野菜及びハーブの場合は、検体約１kgを精密に量り、１mol/L水酸化ナトリウム溶液1,200 mLを加え、細切均一化し、pＨ11以上であることを確認した後、検体20.0ｇに相当する量を量り採る。
茶及びホップの場合は、試料5.00ｇを量り採り、水20 mLを加え、２時間放置する。
これに、１mol/L水酸化ナトリウム溶液20 mLを加え、 pＨ11以上であることを確認する。これにアセトン100 mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50 mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせ､35℃以下で約40 mLに濃縮する。
これに10％塩化ナトリウム溶液100 mLを加え、酢酸エチル及びｎ－ヘキサン（１：４）混液100 mL及び50 mLで２回振とう抽出する。抽出液を合わせ、0.2 mol/L酢酸溶液100 mL及び50 mLで２回振とう抽出する。この抽出液(a)を代謝物の抽出液とする。
一方、残った酢酸エチル及びｎ－ヘキサン混液の層を、10％塩化ナトリウム溶液20 mLに１mol/L水酸化ナトリウム溶液１mLを加えた溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びｎ－ヘキサン（１：49）混液２mLを加えて溶かす。

②　精製
クロマトグラフ管（内径15 mm）に、カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム５ｇをアセトン及びｎ－ヘキサン（１：49）混液に懸濁させて充てんし、無水硫酸ナトリウム約５ｇを積層する。このカラムに①で得られた溶液を注入した後、アセトン及びｎ－ヘキサン（１：49）混液40 mLを注入する。溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトンに溶解し、正確に２mLとしたものをアミトラズの試験溶液とする。

２）代謝物の試験溶液
１）で得られた代謝物を含む抽出液(a)に５mol/L水酸化ナトリウム溶液20 mLを加え、酢酸エチル及びｎ－ヘキサン（１：４）混液100 mL及び50 mLで２回振とう抽出する。抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトンに溶解し、正確に１mLとしたものを代謝物の試験溶液とする。

５．検量線の作成
アミトラズ標準品0.05～1.0 mg/L及び代謝物標準品0.1～2.0 mg/Lを含むアセトン溶液を数点調製し、それぞれ２μLをGCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

６．定量
試験溶液２μLをGCに注入し、５の検量線でアミトラズ及び代謝物の含量を求め、次式により、代謝物を含むアミトラズの含量を求める。

アミトラズ（代謝物を含む）の含量＝アミトラズの含量＋代謝物の含量×1.81

７．確認試験
GC/MSにより確認する。

８．測定条件
１）GC
検出器：FTD又はNPD
カラム：50％フェニル－メチルシリコン　内径0.53 mm、 長さ30ｍ、膜厚1.0μm
カラム温度：100℃（1分）－10℃／分－280℃（15分）
注入口温度：240℃
検出器温度：280℃
キャリヤーガス：ヘリウム
保持時間の目安：アミトラズ17分、代謝物８分

２）GC/MS
カラム：５％フェニル－メチルシリコン　内径0.25 mm、 長さ30ｍ、膜厚0.25μm
カラム温度：100℃（1分）－10℃／分－280℃（15分）
注入口温度：240℃
キャリヤーガス：ヘリウム
イオン化モード（電圧）：EI（70 eV）
主なイオン（m/z）：アミトラズ　293、162、132、121
代謝物　162、132、106、120
注入量：１μL

９．定量限界
各化合物　0.01 mg/kg（穀類、豆類及び種実類：0.02 mg/kg、茶及びホップ：0.04 mg/kg）

10．留意事項
１）試験法の概要
アミトラズ及び代謝物を塩基性下で試料からアセトンで抽出し、酢酸エチル及びｎ－ヘキサン（１：４）混液に転溶する。転溶した溶液から酢酸溶液で代謝物を抽出する。残った溶液を水酸化ナトリウム溶液で洗浄した後、果実、野菜、ハーブ、茶及びホップはそのまま、穀類、豆類及び種実類はアセトニトリル／ヘキサン分配で脱脂した後、合成ケイ酸マグネシウムカラムで精製してアミトラズの試験溶液とする。一方、代謝物を含む酢酸抽出液を塩基性にした後、酢酸エチル及びｎ－ヘキサン（１：４）混液で抽出したものを代謝物の試験溶液とする。両試験溶液をGC-FTD又はGC-NPDで測定し、GC/MSで確認する方法である。

２）注意点
① 代謝物の抽出率を向上させるために、試料に水酸化ナトリウム溶液を加え、pＨ11以上であることを確認する。pＨ11より低い場合は、水酸化ナトリウム溶液を追加する。
② 代謝物の分解を抑えるため、アセトン抽出液の濃縮は低温で短時間に終了させる。
③ 抽出液から酢酸溶液で代謝物を抽出するときは、エマルジョンの生成を防ぐために、緩やかに短時間振とうする。
④ 酢酸溶液で代謝物を抽出した後の酢酸エチル及びｎ－ヘキサン層は、アミトラズの分解を抑えるため、速やかに水酸化ナトリウムを含む塩化ナトリウム溶液で洗浄する。

11．参考文献
　　なし

12．類型
　　Ｃ

メトプレン試験法（農産物）

１．分析対象化合物
メトプレン

２．装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ（HPLC-UV）
液体クロマトグラフ・質量分析計（LC/MS）
ガスクロマトグラフ・質量分析計（GC/MS）

３．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の２に示すものを用いる。
メトプレン標準品　本品はメトプレン98％以上を含む。

４．試験溶液の調製
１）抽出
穀類及び豆類の場合は、試料10.0ｇを量り採り、水20 mLを加え、２時間放置する。
野菜の場合は、試料20.0ｇを量り採る。
これにアセトニトリル100 mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトニトリル50 mLを加え、ホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせ、塩化ナトリウム７ｇを加え、振とうした後、静置し、分離した水層を捨てる。
アセトニトリル層をアセトニトリル飽和ｎ－ヘキサン20 mLで洗浄した後、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物を酢酸エチル30 mLに溶かし、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をｎ－ヘキサン５mLに溶かす。

２）精製
クロマトグラフ管（内径15 mm）に、カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム５ｇをエーテル及びｎ－ヘキサン（１：19）混液に懸濁させて充てんし、無水硫酸ナトリウム約５ｇを積層する。このカラムに１）で得られた溶液を注入した後、流出液は捨てる。さらに、エーテル及びｎ－ヘキサン（１：19）混液40 mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、エーテル及びｎ－ヘキサン（３：17）混液80 mLを注入する。溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をメタノールに溶解し、正確に２mLとしたものを試験溶液とする。

５．検量線の作成
メトプレン標準品の0.05～1.0 mg/Lメタノール溶液を数点調製し、それぞれ20μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

６．定量
試験溶液20μLをHPLCに注入し、５の検量線でメトプレンの含量を求める。

７．確認試験
LC/MS又はGC/MSにより確認する。

８．測定条件
１）HPLC
検出器：UV（265 nm）
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径５μm）、内径4.6 mm、長さ150 mm
カラム温度：40℃
移動相：水及びメタノール（１：９）混液
移動相流速：0.8 mL/分
保持時間の目安：７分

２）LC/MS
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径５μm）、内径２mm、長さ150 mm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び水（９：１）混液
移動相流速： 0.2 mL/分
イオン化モード：ESI（＋）
主なイオン（m/z）：311、279
注入量：１μL
保持時間の目安：８分

３）GC/MS
カラム：５％フェニル－メチルシリコン、内径0.25 mm、長さ30ｍ、膜厚0.25μm
カラム温度：80℃（２分）－20℃/分－200℃（２分）－10℃/分－260℃（８分）
注入口温度：250℃
キャリヤーガス：ヘリウム
キャリヤーガス流速：１mL/分
イオン化モード（電圧）：EI（70 eV）
主なイオン（m/z）：175、153、111
注入量：１μL
保持時間の目安：11分

９．定量限界
0.01 mg/kg

10．留意事項
１）試験法の概要
メトプレンを試料からアセトニトリルで抽出し、塩析で水層を除いた後、アセトニトリル飽和ｎ－ヘキサンで洗浄する。合成ケイ酸マグネシウムカラムで精製した後、HPLC-UVで測定し、LC/MS又はGC/MSで確認する方法である。

２）注意点
① HPLCでは、メトプレンが溶出した後に、成分由来のピークが出現する。
② GC/MSで確認する場合は、試験溶液をｎ－ヘキサンに置換する。精製が不十分な場合は、試験溶液を中性アルミナミニカラムに負荷し、エーテル及びｎ－ヘキサン（３：17）混液20 mLで溶出する精製法を追加するとよい。

11．参考文献
斎藤　勲ら、HPLCによる食品中メトプレンの分析法、食衛誌、47, 173（2006）

12．類型
Ｃ

別紙３

ジクロフルアニド及びトリルフルアニド試験法（農産物）

１． 分析対象化合物
農薬等の成分である物質　　　　　　　　分析対象化合物
ジクロフルアニド 　　　　　　　　　　 ジクロフルアニド
トリルフルアニド　　　　　　　　　　　トリルフルアニド

２． 装置
電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。

３． 試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の２に示すものを用いる。
ジクロフルアニド標準品　本品はジクロフルアニド98％以上を含み、融点は105～106℃である。
トリルフルアニド標準品　本品はトリルフルアニド98％以上を含み、融点は93℃である。

４． 試験溶液の調製
１）抽出
①　穀類、豆類及び種実類の場合
検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その10.0ｇを量り採り、0.3 mol/L塩酸20 mLを加え、２時間放置する。
これにアセトン100 mLを加え、３分間細砕した後、ケイソウ土を１cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50 mLを加え、３分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下で約30 mLに濃縮する。
これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100 mLを入れた300 mLの分液漏斗に移す。ｎ－ヘキサン100 mLを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後、静置し、ｎ－ヘキサン層を300 mLの三角フラスコに移す。水層にｎ－ヘキサン50 mLを加え、上記と同様に操作して、ｎ－ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。ｎ－ヘキサン20 mLを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を２回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下でｎ－ヘキサンを除去する。
この残留物にｎ－ヘキサン30 mLを加え、100 mLの分液漏斗に移す。これにｎ－ヘキサン飽和アセトニトリル30 mLを加え、振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後、静置し、アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。ｎ－ヘキサン層にｎ－ヘキサン飽和アセトニトリル30 mLを加え、上記と同様の操作を２回繰り返し、アセトニトリル層をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下でアセトニトリルを除去する。この残留物にｎ－ヘキサン ５mLを加えて溶かす。

②　果実、野菜、ハーブ、抹茶及びホップの場合
果実、野菜及びハーブの場合は、検体約１kgを精密に量り、６mol/L塩酸100 mLを加える。これに必要に応じ適量の水を量つて加え、細切均一化した後、検体20.0ｇに相当する量を量り採る。
抹茶及びホップの場合は、検体を粉砕した後、その5.00ｇを量り採り、0.3 mol/L塩酸20 mLを加え、２時間放置する。
これにアセトン100 mLを加え、３分間細砕した後、ケイソウ土を１cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50 mLを加え、３分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下で約30 mLに濃縮する。
これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100 mLを入れた300 mLの分液漏斗に移す。ｎ－ヘキサン100 mLを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後、静置し、ｎ－ヘキサン層を300 mLの三角フラスコに移す。水層にｎ－ヘキサン50 mLを加え、上記と同様に操作して、ｎ－ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでｎ－ヘキサン20 mLを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を２回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下で約 ５mLに濃縮する。

③　抹茶以外の茶の場合（ジクロフルアニドの試験を行う場合）
検体9.00ｇを100℃の水540 mLに浸し、室温で５分間放置した後、ろ過し、冷後ろ液360 mLを500 mLの三角フラスコに移す。これにアセトン100 mL及び飽和酢酸鉛溶液２mLを加え、室温で１時間静置した後、ケイソウ土を１cmの厚さに敷いたろ紙を用いて吸引ろ過し、ろ液を1,000 mLの分液漏斗に移す。次いでアセトン50 mLを用いて上記の三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う。洗液を上記の分液漏斗に合わせる。
これに塩化ナトリウム30ｇ及びｎ－ヘキサン100 mLを加え、振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後、静置し、ｎ－ヘキサン層を300 mLの三角フラスコに移す。水層にｎ－ヘキサン100 mLを加え、上記と同様に操作して、ｎ－ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでｎ－ヘキサン20 mLを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を２回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下で約 ５mLに濃縮する。

２）精製
内径15 mm、長さ300 mmのクロマトグラフ管に、カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム10ｇをｎ－ヘキサンに懸濁したもの、次いでその上に無水硫酸ナトリウム約５ｇを入れ、カラムの上端に少量のｎ－ヘキサンが残る程度までｎ－ヘキサンを流出させる。このカラムに１）抽出で得られた溶液を注入した後、エーテル及びｎ－ヘキサン（３：47）混液100 mLを注入し、流出液は捨てる。次いでエーテル及びｎ－ヘキサン（１：１） 混液150 mLを注入し、流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40℃以下でエーテル及びｎ－ヘキサンを除去する。この残留物にｎ－ヘキサンを加えて溶かし、正確に５mLとして、これを試験溶液とする。

５．操作法
１）定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。
操作条件
カラム　内径0.25 mm、長さ10～30ｍのケイ酸ガラス製の細管に、ガスクロマトグラフィー用５％フェニル－メチルシリコンを0.25μmの厚さでコーティングしたもの。
カラム温度　50℃で１分間保持し、その後毎分25℃で昇温する。125℃に到達後、毎分10℃で昇温し、300℃に到達後３分間保持する。
試験溶液注入口温度　250～300℃
検出器　300℃で操作する。
ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。ジクロフルアニドが約15分で流出する流速に調整する。

２）定量試験
１）定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

３）　確認試験
１）定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また、必要に応じ、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

６． 定量限界
ジクロフルアニド　0.01 mg/kg
トリルフルアニド　0.01mg/kg

７． 留意事項
なし

８． 参考文献
なし

９． 類型
Ａ

別紙４

クリスタルバイオレット及びメチレンブルー試験法（畜水産物）

１． 分析対象化合物

２． 装置
可視分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ（HPLC-VIS）
液体クロマトグラフ・質量分析計（LC/MS）

３．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の２に示すものを用いる。
アセトニトリル　液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
水　液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
ギ酸アンモニウム　ギ酸アンモニウム（特級）
クエン酸・リン酸緩衝液（pＨ3.0）
　第１液：クエン酸57.6ｇを量り、水を加えて溶かして1,000 mLとする。
　第２液：リン酸三ナトリウム228ｇを量り、水を加えて溶かして1,000 mLとする。
　第１液に第２液を加えて混和し、pＨを3.0に調整する。
クリスタルバイオレット標準品　本品はクリスタルバイオレット（C25H30ClN3: 407.98）94％以上を含み、融点は215℃である。
メチレンブルー標準品　本品はメチレンブルー（C16H18N3SCl: 319.85）97％以上を含み、融点は169～170℃である。

４．試験溶液の調製
試料5.00ｇを量り採り、クエン酸・リン酸緩衝液（pＨ3.0）10 mLを加えて５分間細砕する。これにアセトニトリル40 mLを加え、振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後、毎分2,600回転で５分間遠心分離し、アセトニトリル－水層を分液ロートに採る。残留物にアセトニトリル20 mLを加え、上記と同様に操作し、得られたアセトニトリル層を先の分液ロートに合わせる。これにｎ-ヘキサン80 mLを加えて激しく振り混ぜた後、静置し、アセトニトリル層を採る。これに20％塩化ナトリウム溶液50 mL及びジクロロメタン50 mLを加えて５分間振とうした後、静置し、アセトニトリル－ジクロロメタン層を採る。
これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過し、40℃以下でアセトニトリル－ジクロロメタン層を除去する。この残留物にアセトニトリル2.0 mLを加えて溶かし、これを試験溶液とする。

５．検量線の作成
各標準品の10 mg/100 mLメタノール溶液を調製し、アセトニトリル及び0.01 mol/Lギ酸アンモニウム溶液（１：９）混液で希釈して0.0125～0.5mg/Lの標準溶液を数点調製する。それぞれHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

６．定量
試験溶液をHPLCに注入し、５の検量線で各物質の含量を求める。

７．確認試験
LC/MSにより確認する。

８．測定条件
HPLC
検出器：VIS（測定波長636 nm）
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル　内径 2.0～6.0 mm、長さ 100～250 mm、粒子径２～５μm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び0.01 mol/Lギ酸アンモニウム溶液の混液（１：９）から（１：０）までの濃度勾配を20分間で行い、（１：０）で10分間保持する。
保持時間の目安：12分（メチレンブルー）

９．定量限界
クリスタルバイオレット　0.005 mg/kg
メチレンブルー　0.005 mg/kg

10．留意事項
１）試験法の概要
クリスタルバイオレット及びメチレンブルーを試料からアセトニトリル及びクエン酸・リン酸緩衝液（pＨ3.0）で抽出し、ジクロロメタンに転溶した後、HPLC-VISで測定し、LC/MSで確認する方法である。

２）注意点
① ジクロロメタン転溶の際に溶媒が乳化する場合は、遠心分離等により層を完全に分離すること。
② HPLC-VIS及びLC/MSにおける標準溶液及び試験溶液の標準的な注入量は、内径3.0 mmのカラムにおいて10μLであるが、カラム及び装置により最適な注入量が異なる場合があるので、必要に応じて最適注入量を検討すること。
③ LC/MSにおける測定条件は用いる装置により、最適なイオン化方法、生成するイオンが異なる場合があるので、装置ごとに最適条件を検討すること。

11．参考文献
春日ら、食品衛生学雑誌、32, 137（1991）

12．類型
Ｃ

セファゾリン、セファピリン、セファレキシン、セファロニウム、
セフォペラゾン及びセフロキシム試験法（畜水産物）

１． 分析対象化合物

２． 装置
液体クロマトグラフ・質量分析計（LC/MS）

３．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の２に示すものを用いる。
アセトニトリル　液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
水　液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
メタノール　液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
ジビニルベンゼン-N-ビニルピロリドン共重合体ミニカラム（60 mg）　内径12～13 mmのポリエチレン製のカラム管にジビニルベンゼン-N-ビニルピロリドン共重合体60 mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。
セファゾリンナトリウム標準品　本品はセファゾリンナトリウム97％以上を含む。
セファピリンナトリウム標準品　本品はセファピリンナトリウム90％以上を含む。
セファレキシン標準品　本品はセファレキシン99％以上を含む。
セファロニウム標準品　本品はセファロニウム98％以上を含む。
セフォペラゾンナトリウム標準品　本品はセフォペラゾンナトリウム95％以上を含む。
セフロキシムナトリウム標準品　本品はセフロキシムナトリウム99％以上を含む。

４．試験溶液の調製
１）抽出
① 筋肉の場合
試料5.00ｇを量り採り、メタノール及び0.2%メタリン酸溶液（３：７）混液100 mLを加えて細砕した後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にメタノール及び0.2%メタリン酸溶液（３：７）混液20 mLを加えてかき混ぜた後、上記と同様に操作して、ろ液を合わせ、40℃以下で約30 mLに濃縮する。

② 脂肪の場合
試料5.00ｇを量り採り、ｎ-ヘキサン30 mL及び0.2%メタリン酸溶液70 mLを加えて細砕した後、毎分3,000回転で５分間遠心分離し、0.2%メタリン酸溶液層を採る。

③ 肝臓、腎臓、乳及びその他の食用部分の場合
試料5.00ｇを量り採り、メタノール及び0.2%メタリン酸溶液（３：７）混液100 mLを加えて細砕し、ケイソウ土３ｇを加えて混和した後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にメタノール及び0.2%メタリン酸溶液（３：７）混液20 mLを加えてかき混ぜた後、上記と同様に操作して、ろ液を合わせ、40℃以下で約30 mLに濃縮する。

２）精製
ジビニルベンゼン-N-ビニルピロリドン共重合体ミニカラム（60 mg）に、メタノール５mL及び水５mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに１）で得られた溶液を注入した後、水５mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムにメタノール５mLを注入し、溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40℃以下でメタノールを除去する。この残留物に水及びメタノール（７：３）混液1.0 mLを加えて溶かし、これを試験溶液とする。

５．検量線の作成
セファロニウム標準品は10 mgを水３ mLに溶解後、メタノールを加えて100 mLとする。その他の各標準品は10 mg/100 mLメタノール溶液を調製する。これらを水及びメタノール（７：３）混液で希釈して0.05～５mg/Lの標準溶液を数点調製する。それぞれLC/MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

６．定量
試験溶液をLC/MSに注入し、５の検量線で各物質の含量を求める。

７．確認試験
LC/MSにより確認する。

８．測定条件
LC/MS
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル　内径 2.0～6.0 mm、長さ 100～250 mm、粒子径２～５μm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び0.01%ギ酸溶液の混液（１：19）から（１：１）までの濃度勾配を20分間で行う。
主なイオン（m/z）： セファゾリン ESI＋において455
セファピリン ESI＋において424
セファレキシン ESI＋において348
セファロニウム ESI＋において459
セフォペラゾン ESI＋において646又はESI－において644
セフロキシム ESI－において423
保持時間の目安：10分（セファピリン）

９．定量限界
各分析対象化合物について0.01 mg/kg

10．留意事項
１）試験法の概要
セファゾリン、セファピリン、セファレキシン、セファロニウム、セフォペラゾン及びセフロキシムを試料からメタノール及び0.2%メタリン酸溶液の混液、または、0.2%メタリン酸溶液で抽出し、ジビニルベンゼン-N-ビニルピロリドン共重合体ミニカラムで精製した後、LC/MSで測定及び確認する方法である。

２）注意点
① LC/MSにおける標準溶液及び試験溶液の標準的な注入量は、内径3.0 mmのカラムにおいて10μLであるが、カラム及び装置により最適な注入量が異なる場合があるので、必要に応じて最適注入量を検討すること。
② LC/MSにおける測定条件は用いる装置により、最適なイオン化方法、生成するイオンが異なる場合があるので、装置ごとに最適条件を検討すること。

11．参考文献
なし

12．類型
Ｃ